اثر انجماد شیشه ای رویان موش بر تغییرات هیستونی و بیان ژن آنزیم های تغییردهنده ی هیستونی

در عالم طبیعت هنگامی که لقاح صورت می¬گیرد،گامت نر و گامت ماده، طی دو فرآیند شکل¬گیری مجدد هسته¬ای و برنامه-ریزی مجدد هسته¬ای به وضعیت کاملاً تمایز نیافته و همه¬توان بر می¬گردند. طی فرآیند برنامه¬ریزی مجدد هسته¬ای، تغییرات پیچیده اپی¬ژنتیکی در ژنوم رویان، چه در سطح dna و چه در سطح هیستون¬ها رخ می¬دهد که اثر بسیار مهمی بر روی تکوین یک موجود دارد. از آن¬جایی¬که در پستانداران عوامل محیطی طی اوایل تکوین نقش تعیین کننده‏ای را در تنظیم اپی‏ژنتیکی بر عهده دارند، از این¬رو در این رساله به بررسی اثر روش‏های کمک تولید مثلی بر میزان زنده¬مانی و توانایی نمو و هم¬چنین ارزیابی چند نشانگر اپی¬ژنتیکی هیستونی در مرحله¬ی پیش از لانه¬گزینی و بیان ژن آنزیم¬های درگیر در این تغییرات و نیز بیان ژن نشانگرهای پرتوان sox2، pou5f1 وnanog در دو مرحله¬ی پیش از لانه گزینی و پس از آن پرداخته شد. هم¬چنین به منظور بررسی اثر روش¬های کمک تولیدمثلی بر روی میزان توانایی نمو جنین، میزان جایگاه جذب و جایگاه لانه¬گزینی و هم¬چنین وزن جفت و جنین در روز 5/9 جنینی مورد بررسی قرار گرفت. در مرحله¬ی پیش از لانه¬گزینی چهار گروه تیماری شامل گروه¬هایc (کنترل)، s (تحریک تخمک¬ریزی)، si (تحریک تخمک¬ریزی + کشت در شرایط برون¬تنی) و svi (تحریک تخمک¬ریزی + انجماد شیشه¬ای + کشت در شرایط برون¬تنی) مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج نشان داد که میزان تشکیل بلاستوسیست و شکوفایی بلاستوسیست در گروه svi به¬میزان معنی¬داری پائین¬تر از گروه si می¬باشد (05/0>p). آنالیز نیمه کمی نشانگرهای اپی¬ژنتیکی در تروفکتودرم نشان داد که گروه c پائین¬ترین شدت نور فلورسنت هسته¬ای را برای این سه نشانگر دارا می¬باشد و این تفاوت تنها برای استیله شدن 9k3h معنی¬دار بود (05/0>p). برای استیله شدن 12k4h میزان شدت نور فلورسنت در گروه svi به¬میزان معنی¬داری بالاتر از گروه¬های sوc بود که این تفاوت را می¬توان به تنش حاصل شده از مواد محافظ انجمادی و سرمای وارد شده به این سلول¬ها نسبت داد. بررسی این نشانگرها در توده¬ی درونی سلولی نشان داد که گروه sبرای استیله شدن 9k3h نسبت به گروه¬های c و si و برای تری متیله شدن 4k3h نسبت به گروه si وsvi به¬میزان معنی¬داری بالاتر بود (05/0>p). این نتیجه را می¬توان این گونه توضیح داد که تخمک¬های به¬دست آمده از موش¬های تحریک تخمک¬ریزی شده ممکن است به اندازه تخمک¬های حاصله از موش¬هایی که سیکل طبیعی داشتند، توانا نباشند. برپایه این فرض انتظار می¬رود که بلاستوسیست¬های به¬دست آمده از گروه¬های si و svi میزان بالایی از استیله شدن 9k3h و تری متیله شدن 4k3h را داشته باشند اما در عمل چنین نبود. این تفاوت¬ها می¬تواند به این دلیل باشد که تخمک ¬های نامناسب به¬دست آمده از تحریک تخمک-ریزی ممکن است در گروه¬های si و svi تحت کشت در شرایط برون¬تنی و انجماد شیشه¬ای به مرحله بلاستوسیست نرسیده باشند و در نتیجه بلاستوسیست¬هایی که از تخمک ¬های با شایستگی بالا حاصل شده¬اند در این گروه¬ها مورد ارزیابی قرار گرفته-اند. بنابراین میزان این تغییرات اپی¬ژنتیکی در دو گروه si و svi شبیه به گروه c است. بررسی نتایج حاصل از بیان ژن¬ها در این مطالعه نشان داد که دستکاری¬های موجود در روش¬های کمک تولید مثلی القاء کننده¬ی الگوی بیانی غیر طبیعی ژن¬ها در این مرحله می¬باشند. از آن¬جایی¬که در تمام ژن¬های بررسی شده در رویان در مرحله¬ی بلاستوسیست تفاوت معنی¬داری در میزان بیان ژن بین گروه¬های تیماری si و svi دیده نشد، می¬توان گفت که انجماد شیشه¬ای رویان دو سلولی موش اثرخاصی بر میزان بیان ژن آنزیم¬های درگیر در تغییرات اپی¬ژنتیکی و هم¬چنین بیان ژن نشانگرهای پرتوان بررسی شده در مرحله¬ی پیش از لانه¬گزینی، در مقایسه با کشت در شرایط برون¬تنی ندارد. به¬منظور بررسی¬های پس از لانه¬گزینی علاوه بر داشتن دو گروه c و s، گروه¬های ct، st، sit و svit هم که در آن¬ها عمل انتقال رویان علاوه بر دستکاری¬های دیگر صورت گرفته بود مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج نشان داد که با افزایش دستکاری¬ها، درصد جایگاه جذب افزایش و وزن جنین کاهش می¬یابد. کاهش وزن جنین در گروه تیماری s که تنها تیمار تحریک تخمک¬ریزی بر روی آن¬ها صورت گرفته بود نسبت به گروه c معنی¬دار بود (05/0>p). داده¬های به¬دست آمده از بیان ژن¬ها در جنین 5/9 روزه نشان داد که میزان بیان بیشتر ژن¬ها در گروه تیماری s، با گروه¬های دیگر متفاوت است. دلیل این تفاوت را می¬توان این¬گونه توضیح داد که تحریک تخمک¬ریزی باعث آزادسازی تخمک¬های غیرطبیعی گردد. این اتفاق از طریق وادار کردن تخمک¬ها برای تکوین خیلی سریع و یا آزاد شدن تخمک¬هایی که از قبل برای پس روی کردن انتخاب شده اند، صورت می گیرد. بنابراین نشانگرهای اپی¬ژنتیکی در این گروه¬ها دستخوش تغییر شده والگوی بیان ژن¬ها نیز غیر طبیعی می¬شود. هم¬چنین تزریق اگزوژنوسی هورمون ها می تواند باعث شود که میزان استرادیول سرم خون نسبت به گروه کنترل که چرخه¬ی تخمک¬ریزی طبیعی دارد افزایش یافته و شرایط متفاوتی در محیط رحم حاصل شود واثر منفی بر وضعیت بیان ژن¬ها بگذارد.